Sản xuất in vitro axit gymnemic từ nuôi cấy huyền phù tế bào của dây thìa canh

By | January 7, 2020
Spread the love

Dây thìa canh là một cây thuốc quan trọng mang hợp chất hoạt tính sinh học là axit gymnemic. Công việc hiện tại đề cập đến việc tối ưu hóa hệ thống nuôi cấy tế bào của Dây thìa canh để sản xuất sinh khối và axit gymnemic, có đặc tính chống tiểu đường. Chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ inoculum (2,5, 2020 g / L), sức mạnh của môi trường Murashige và Skoog (MS) (0,25 Nott2.0), nguồn carbon (sucrose, glucose, fructose, maltose) và nồng độ của sucrose (1 Tắt8% w / v) để xác định ảnh hưởng của chúng đối với sự tích lũy sinh khối và sản xuất axit gymnemic. Nhìn chung, mật độ tiêm truyền 10 g / L, môi trường MS đầy đủ được bổ sung 2,4 ‐ dichlorophenoxy acetic acid (2,0 mg / L) và Kinetin (0,1 mg / L) và 3% w / v sucrose được tìm thấy tốt nhất cho sự tích lũy của sinh khối và hàm lượng axit gymnemic (9,95 mg / g trọng lượng khô). Các kết quả của nghiên cứu hiện tại sẽ hữu ích cho các kỹ sư xử lý sinh học và sinh hóa để sản xuất axit gymnemic quy mô lớn trong nuôi cấy tế bào.

Cây thìa canh là một cây thuốc quan trọng và được biết đến với tên gọi phổ biến là Gur Gur ‐ mar vì đặc tính đặc biệt của nó là tạm thời phá hủy hương vị của vị ngọt và được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường 1 . Nó cũng sở hữu các đặc tính chống vi khuẩn, chống tăng cholesterol máu và bảo vệ gan. Lá của các loài có chứa saponin triterpene thuộc nhóm oleanane và dammarene, trước đây là axit gymnemic.

Các thành phần chống tiểu đường của cây được xác định là một nhóm các axit gymnemic có liên quan chặt chẽ sau khi phân lập và tinh chế thành công từ lá. Gần đây, các công thức axit gymnemic đã được tìm thấy là hữu ích chống lại béo phì 1 . Trong y học cổ truyền, các hợp chất này thu được dưới dạng chiết xuất hoặc dịch truyền từ cây hoang dã hoặc cây trồng Dây thìa canh , làm giảm mạnh dân số của loại cây này. Một cách để giảm thiểu vấn đề này là phát triển nuôi cấy mô thực vật của loài này, vì kỹ thuật công nghệ sinh học này cung cấp một quy trình chiết xuất thay thế có thể sử dụng tế bào, mô và cơ quan theo cách vô trùng, có thể kiểm soát, tự động hóa và dẫn đến việc trồng trọt quy mô lớn 2. Có một số báo cáo sơ bộ về văn hóa mô sẹo và tế bào huyền phù ở Dây thìa canh ; tuy nhiên, đây là cách tiếp cận có hệ thống đầu tiên để thiết lập một hệ thống nuôi cấy tế bào để sản xuất axit gymnemic 3 – 5 . Do đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu hiện tại để phát triển nuôi cấy huyền phù tế bào của Dây thìa canhChúng tôi đã kiểm tra ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau, như mật độ cấy, sức mạnh của môi trường Murashige và Skoog (MS) 6 , nguồn carbon và nồng độ sucrose trong môi trường đối với năng suất của axit gymnemic.

Nuôi cấy huyền phù tế bào của Dây thìa canh đã được bắt đầu bằng cách sử dụng mô sẹo có thể đóng gói (500 mg) trong 50 ml môi trường chất lỏng MS bổ sung 2,0 mg / L 2,4 D + 0,1 mg / L Kinetin (KN) trong 250 ml bình Erlenmeyer. Các mẫu được nuôi cấy liên tục ở tốc độ 110 vòng / phút trong máy lắc quỹ đạo (Orbitek, Scigenics, Chennai, Ấn Độ) và được ủ ở 25 ± 2 ° C, với photoperiod 16 giờ (40 μmol m 2  s 1 ) được cung cấp bởi 40 W đèn huỳnh quang trắng (Philips, Kolkata, Ấn Độ). Một thử nghiệm theo thời gian được thực hiện đối với việc sản xuất và nuôi cấy axit sinh khối và gymnemic được duy trì trong 5 tuần, với các mẫu được lấy trong khoảng thời gian hàng tuần.

Để xác định mật độ cấy tối ưu, các mức chế phẩm khác nhau (2.5, 5.0, 10.0 và 20.0 g / L) đã được sử dụng trong các thí nghiệm riêng biệt. Trong một tập hợp thí nghiệm khác, hiệu quả của các thế mạnh khác nhau của môi trường MS (0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,50 và 2,0 ×) đã được thử nghiệm để sản xuất sinh khối và axit gymnemic. Tác dụng của các nguồn carbohydrate khác nhau (sucrose, glucose, fructose, maltose, glucose + fructose (1: 1), fructose + sucrose (1: 1) và sucrose + glucose (1: 1)) và ảnh hưởng của nồng độ sucrose khác nhau ( 1, 2, 3, 4, 6 và 8%, w / v) đã được áp dụng cho việc tích lũy sinh khối và sản xuất axit gymnemic tùy thuộc vào mục tiêu của thí nghiệm. Tất cả các loại đường đều được khử trùng bằng bộ lọc bằng ống tiêm vô trùng 0,22 beforem trước khi thêm vào các phương tiện khác nhau. Sau 4 tuần văn hóa, sự tăng trưởng của huyền phù tế bào được đánh giá cho sự tích lũy sinh khối và axit gymnemic. Phân tích axit gymnemic được HPLC thực hiện bằng giao thức chuẩn của Chromadex (Laguna Hills, CA, USA). Tất cả các thí nghiệm đã được thiết lập trong một thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên và dữ liệu phải chịu thử nghiệm đa phạm vi của Duncan bằng phần mềm SPSS phiên bản 9.0.

Để xác định sự tích lũy sinh khối và sản xuất axit gymnemic theo thời gian môi trường MS được bổ sung 2,0 mg / L 2,4 ‐ dichlorophenoxy acetic acid (2,4 ‐ D) +0,1 mg / L KN và 30 g / L sucrose đã được sử dụng. Các kết quả được trình bày trong hình 1 . Sự tích lũy sinh khối tối đa được ghi nhận vào cuối tuần thứ tư (11,56 g / L trọng lượng khô (DW)). Sự tích lũy axit gymnemic trong các tế bào nuôi cấy cũng theo xu hướng tương tự và tích lũy axit gymnemic tối ưu (9,95 mg / g DW) trong các tế bào sau tuần thứ tư (Hình 1 ). Sau các khóa học thời gian này, rõ ràng là sự tăng trưởng sinh khối tương quan chặt chẽ với sự tích lũy axit gymnemic. Kết quả tương tự cũng thu được trong quá trình nuôi cấy tế bào Withania somniferađể sản xuất withanolide A 7 .

Sản xuất in vitro axit gymnemic từ nuôi cấy huyền phù tế bào của dây thìa canh

Hình 1

Mở trong hình người xem PowerPoint

Hồ sơ thời gian phát triển tế bào và sản xuất axit gymnemic trong môi trường nuôi cấy tế bào huyền phù quy mô của Cây dây thìa canh500 mg tế bào được nuôi cấy trong 50 ml môi trường MS được bổ sung 2,0 mg / L 2,4 D + 0,1 mg / L KN và 30 g / L sucrose. Các phương tiện có các chữ cái phổ biến không khác biệt đáng kể ở p .050,05 theo thử nghiệm đa phạm vi (DMRT) của Duncan.

Tầm quan trọng của việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy thường được đánh giá thấp trong quá trình nuôi cấy huyền phù. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng kích thước inoculum ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự tăng trưởng và sản lượng của betalain từ nuôi cấy rễ củ cải đỏ 8 . Để hiểu được ảnh hưởng của mật độ cấy đối với sự tích lũy sinh khối và axit gymnemic trong quá trình nuôi cấy huyền phù của thí nghiệm Cây dây thìa canh đã được bắt đầu với mật độ nuôi cấy khác nhau (2.5, 5.0, 10.0 và 20.0 g / L). Cấy 10 g / L đã được tìm thấy dẫn đến sinh khối tối đa (11,25 g / L DW; Hình 2A ). Sản lượng cao nhất của axit gymnemic (9,95 mg / g DW) cũng được ghi nhận ở mật độ tiêm chủng 10 g / L. Loại cấy cao hơn (20 g / L) và thấp hơn (2,5 g / L) không phù hợp với sinh khối (Hình 2A) và sản xuất axit gymnemic. Trong W. somnifera treo tế bào, 10 g / L kích thước cấy đã được tìm thấy phù hợp cho cả tăng trưởng tế bào và withanolide-A sản xuất 2,5-20,0 g / mật độ cấy L thử nghiệm 7 .

Sản xuất in vitro axit gymnemic từ nuôi cấy huyền phù tế bào của dây thìa canh

Hình 2

Mở trong hình người xem PowerPoint

Ảnh hưởng của mật độ cấy (A), cường độ trung bình (B) và nồng độ sucrose (C) đến quá trình tích lũy sinh khối và sản xuất axit gymnemic bằng phương pháp nuôi cấy tế bào của Cây thìa canh . Khoảng 500 mg tế bào được nuôi cấy trong 50 ml môi trường MS được bổ sung 2,0 mg / L 2,4 D + 0,1 mg / L KN và 30 g / L sucrose trong 4 tuần. Các phương tiện có các chữ cái phổ biến không khác biệt đáng kể ở p .050,05 theo thử nghiệm đa phạm vi (DMRT) của Duncan.

Nồng độ dinh dưỡng tối ưu là một yếu tố quyết định quan trọng trong việc kiểm soát sự phát triển của các tế bào / cơ quan và sự tích lũy các chất chuyển hóa thứ cấp 9 . Ví dụ, môi trường MS một nửa sức mạnh có hiệu quả để tăng cường tích lũy sinh khối và tổng hợp phenol trong nuôi cấy rễ phiêu lưu của Echinacea angustifolia trong số các môi trường MS (0,25 Thay2 ×) được thử nghiệm 10 . Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi đã thử nghiệm ảnh hưởng của môi trường MS cường độ 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5 và 2,0 đối với tích lũy sinh khối và sản xuất axit gymnemic. Kết quả cho thấy môi trường MS toàn lực ủng hộ việc tích lũy sinh khối (11,54 g / L DW) và sản xuất axit gymnemic (9,95 mg / g DW; Hình 2B). Độ bền muối cao hơn và thấp hơn của môi trường MS dẫn đến ưu việt không ủng hộ tích lũy sinh khối và hàm lượng chất chuyển hóa. Những kết quả này ngụ ý rằng các tế bào lơ lửng của Cây thìa canh yêu cầu mức độ muối trung bình tối ưu cho sinh khối tích lũy cũng như các chất chuyển hóa thứ cấp.

Nó đã được báo cáo rằng một số loại đường (sucrose, fructose, maltose hoặc glucose) được sử dụng trong môi trường có thể ảnh hưởng đến sinh khối và tích lũy chất chuyển hóa thứ cấp, và điều cần thiết là tập luyện kết hợp đường phù hợp trong môi trường nuôi cấy để đạt được mức độ thứ cấp cao hơn chất chuyển hóa 11 . Môi trường MS được bổ sung 2,0 mg / L 2,4 D + 0,1 mg / L KN và 30 g / L sucrose / glucose / fructose / maltose / glucose + fructose (1: 1) / fructose + sucrose (1: 1) / sucrose + glucose (1: 1) đã được thử nghiệm. Kết quả của các nguồn carbon khác nhau về tích lũy sinh khối và sản xuất axit gymnemic từ nuôi cấy tế bào được trình bày trong Bảng 1. Sucrose được tìm thấy là nguồn carbohydrate lý tưởng cho sự tích lũy sinh khối, mang lại sinh khối 11,56 g / L DW. Sản lượng cao nhất của hàm lượng axit gymnemic là 9,95 mg / g DW được ghi nhận trong môi trường bổ sung 3% sucrose (Bảng 1 ). Sự hấp thu và sử dụng các loại đường khác nhau có thể khác nhau với các tế bào thực vật khác nhau như báo cáo của Srinivasan et al. 12 và có thể là do hệ thống enzyme có trong chúng để sử dụng ưu đãi.

Bảng 1. Nuôi cấy huyền phù tế bào Dây thìa canh : ảnh hưởng của các nguồn carbohydrate khác nhau đến tích lũy sinh khối và sản xuất axit gymnemic
Nguồn carbohydrate (3%) Trọng lượng tươi (g / L) DW (g / L) Tỷ lệ tăng trưởng Hàm lượng axit gymnemic (mg / g DW)
Sucrose 125,67 ± 2,20 a 11,56 ± 0,21 a 10,16 9,95 ± 0,03 a
Glucose 118,00 ± 4,03 a 10,66 ± 0,36 a 9,69 8,56 ± 0,03 d
Fructose 100,91 ± 3,69 b 9,23 ± 0,44 b 8,39 6,58 ± 0,04 f
Maltose 86,50 ± 2,54 c 7,68 ± 0,26 c 6,98 6,99 ± 0,05 đ
Glucose + fructose (1: 1) 100,90 ± 3,48 b 9,07 ± 0,34 b 8,24 8,72 ± 0,01 c
Fructose + sucrose (1: 1) 94,25 ± 1,33b c 8,36 ± 0,12b c 7,60 9,26 ± 0,03 b
Sucrose + glucose (1: 1) 117,22 ± 4,76 a 10,66 ± 0,47 một 9,69 9,24 ± 0,03 b
  • Một nền văn hóa được trồng trong 250 ml bình nón chứa 50 ml môi trường MS được bổ sung 2,0 mg / L 2,4 D + 0,1 mg / L KN trong 4 tuần. Dữ liệu đại diện cho giá trị trung bình ± SE của ba lần lặp; mỗi thí nghiệm được lặp lại hai lần. Các phương tiện có các chữ cái phổ biến trong một cột không khác biệt đáng kể ở .050,05 theo thử nghiệm đa phạm vi của Duncan.

Nuôi cấy tế bào thực vật thường được trồng dị hóa bằng cách sử dụng các nguồn đường và carbon đơn giản và mức độ sucrose đã được chứng minh là ảnh hưởng đến năng suất của chất chuyển hóa thứ cấp nuôi cấy tích lũy 11 . Do đó, nồng độ sucrose 3% ủng hộ tích lũy sinh khối tối đa trong khi nồng độ cao hơn 5 và 7% sucrose ủng hộ việc sản xuất ginkgolide và bilobalide trong Ginkgo biloba 13 . Trong môi trường nuôi cấy chồi Bacopa monnieri tích lũy sinh khối 2% sucrose, trong khi sucrose ‐ môi trường tự do tích lũy tối đa lượng bacoside Hàm lượng 14 . Trong số các nồng độ khác nhau của sucrose (1 Lần8% w / v) được thử nghiệm trong các nghiên cứu hiện tại, chúng tôi thấy rằng 3% sucrose ủng hộ việc tích lũy sinh khối (Hình.2C ), trong khi lượng axit gymnemic cao nhất (10,1 mg / g DW) được tích lũy ở mức 4% sucrose (Hình 2C ). Những phát hiện này chứng minh rằng nồng sucrose cao tăng cường sự tích tụ của acid gymnemic và điều này có thể là do nồng độ cao của thẩm thấu căng thẳng 15 .

Nghiên cứu hiện tại cho thấy rằng tiêm 10 g / L, môi trường MS đầy đủ, 3% w / v sucrose phù hợp để sản xuất sinh khối và axit gymnemic từ nuôi cấy huyền phù tế bào của Dây thìa canh . Những kết quả này cho thấy khả năng sản xuất axit tgymnemic cho mục đích thương mại ở quy mô lớn sử dụng nuôi cấy huyền phù trong ống nghiệm trong lò phản ứng sinh học.

Nguồn:
Sản xuất in vitro axit gymnemic từ nuôi cấy huyền phù tế bào của dây thìa canh


Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *